产品货号：
ZN2299
中文名称：
人天冬酰胺内肽酶(Legumain)检测试剂盒(ELISA方法)
英文名称：
Human Legumain ELISA Kit
产品规格：
96T
发货周期：
1～3天
产品价格：
询价
本试剂盒采用夹心法酶联免疫吸附法，用于体外定量分析人血清、血浆、细胞裂解液或细胞培养上清中Legumain的含量。
预先包被的抗体为Legumain多克隆抗体。检测相抗体为Legumain单克隆抗体，经生物素标记。样品和生物素标记抗体先后加入酶标板孔反应后，PBS或TBS洗涤。随后加入过氧化物酶标记的亲和素反应；经过PBS或TBS的彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的Legumain呈正相关。
Legumain又称天冬酰胺内肽酶(asparaginyl endopeptidase,AEP)，是一种溶酶体半胱氨酸蛋白酶，属于半胱氨酸蛋白酶C13家族的新成员。最初是在豆类植物种子中发现的。随后在人体也发现了Legumain，其基因定位于14号染色体。研究表明，Legumain作为一种应激反应蛋白，只在特定条件下表达。在哺乳类动物具有抗凋亡作用，在炎性反应过程中起抗原呈递作用。在多种实体瘤、肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)、肿瘤新生血管的内皮细胞中高表达，与恶性肿瘤的血管生成、肿瘤侵袭、扩散和转移密切相关，是近年来备受关注的一类靶标蛋白酶。对Legumain的深入研究将有利于阐明恶性实体瘤的发病机制，明确其作为肿瘤基因治疗新靶标的有效性。
检测指标：Legumain；LGMN；天冬酰胺內肽酶；AEP；半胱氨酸蛋白酶legumain
检测范围：31.2pg/ml～2000pg/ml
特异性：系统和其它细胞因子无交叉反应
敏感性：＜4pg/ml
保存：2～8℃，有效期6个月。长期不用请置于-20℃可保存1年。
样品如果不立即分析，应分装后冷冻保存，且避免反复冻融。
用户须估计样品待测因子的含量，决定适当的稀释倍数，以使稀释后样品中待测因子的浓度处于ELISA试剂盒的最佳检测范围。根据待测因子含量高、中、低的不同，分别采取不同的稀释方案，以下方案仅供参考，样品的稀释应有详细记录。
已稀释好的ABC和TMB显色液在加入酶标板孔前都应预先在37℃中平衡至少30分钟。试剂或样品稀释时，切不可忘记混匀。每次检测都应该做标准曲线。用户须估计样品待测因子的含量，决定适当的稀释倍数。
取自某些批次质检数据，仅供参考，用户需要自己建立标准曲线。
相关搜索：人天冬酰胺内肽酶(Legumain)检测试剂盒(ELISA方法)，人Legumain检测试剂盒，人LGMN检测试剂盒，人天冬酰胺內肽酶检测试剂盒，人AEP检测试剂盒，人半胱氨酸蛋白酶legumain检测试剂盒，Human Legumain ELISA Kit
预先包被的抗体为Legumain多克隆抗体。检测相抗体为Legumain单克隆抗体，经生物素标记。样品和生物素标记抗体先后加入酶标板孔反应后，PBS或TBS洗涤。随后加入过氧化物酶标记的亲和素反应；经过PBS或TBS的彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的Legumain呈正相关。
Legumain又称天冬酰胺内肽酶(asparaginyl endopeptidase,AEP)，是一种溶酶体半胱氨酸蛋白酶，属于半胱氨酸蛋白酶C13家族的新成员。最初是在豆类植物种子中发现的。随后在人体也发现了Legumain，其基因定位于14号染色体。研究表明，Legumain作为一种应激反应蛋白，只在特定条件下表达。在哺乳类动物具有抗凋亡作用，在炎性反应过程中起抗原呈递作用。在多种实体瘤、肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)、肿瘤新生血管的内皮细胞中高表达，与恶性肿瘤的血管生成、肿瘤侵袭、扩散和转移密切相关，是近年来备受关注的一类靶标蛋白酶。对Legumain的深入研究将有利于阐明恶性实体瘤的发病机制，明确其作为肿瘤基因治疗新靶标的有效性。
检测指标：Legumain；LGMN；天冬酰胺內肽酶；AEP；半胱氨酸蛋白酶legumain
检测范围：31.2pg/ml～2000pg/ml
特异性：系统和其它细胞因子无交叉反应
敏感性：＜4pg/ml
| 组分 | 规格 | 数量 |
| 预包被抗人Legumain抗体的96孔板 | 96T | 1板 |
| 重组人Legumain标准品(冻干) | 10ng/管 | 2管 |
| 生物素标记抗人Legumain(100X) | 100μL | 1管 |
| 亲和素-过氧化物酶复合物(ABC)(100X) | 100μL | 1管 |
| 样品稀释液 | 30mL | 1瓶 |
| 抗体稀释液 | 12mL | 1瓶 |
| ABC稀释液 | 12mL | 1瓶 |
| TMB显色液 | 10mL | 1瓶 |
| 终止液 | 10mL | 1瓶 |
| 洗涤缓冲液(25X) | 20mL | 1瓶 |
| 封板膜 | 4张 |
保存：2～8℃，有效期6个月。长期不用请置于-20℃可保存1年。
- 标准规格酶标仪。
- 自动洗板机。
- 恒温箱
- 系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，最好用多通道移液器。
- 干净的试管和Eppendof管。
- 用去离子水将25X洗涤缓冲液稀释25倍，成1X洗涤缓冲液。
- 使用前TMB显色液应为无色透明溶液，若发现颜色异常，请及时与我司联系。
- 用户在初次使用试剂盒时，应将各种试剂管离心数分钟，以便试剂集中到管底。
- 要严格避免操作过程中酶标板干燥。干燥会使酶标板上生物成份迅速失活。
- 为免交叉污染，要避免重复使用手中的吸头和试管。
- 禁止混用不同批次试剂盒内的试剂。
- 本公司提供的96孔酶标板是单条可拆型酶标板，用户可按需求使用；剩余的酶标板请按保存条件贮存。
- 揭封板膜和覆盖封板膜时应避免用力过大导致液体溅出。
- 手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将1X洗涤缓冲液至少300μL注入孔内，浸泡1～2分钟。根据需要，重复此过程数次。
- 自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
样品如果不立即分析，应分装后冷冻保存，且避免反复冻融。
- 细胞培养上清：离心去除沉淀，立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
- 血清：用干净试管收集血液，室温凝固30分钟，离心2000×g 20分钟，收集血清。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
- 血浆：采用肝素、柠檬酸盐或EDTA抗凝，抽血后30分钟内在2～8℃离心2000×g 20分钟。为消除血小板的影响，建议在2～8℃进一步离心10000×g 10分钟。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
- 贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入适量裂解液，用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。通常10秒后，细胞就会被裂解。
- 悬浮细胞：离心收集细胞，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入适量裂解液，用枪吹打把细胞吹散，用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后，10000～14000g离心3～5分钟，取上清。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
用户须估计样品待测因子的含量，决定适当的稀释倍数，以使稀释后样品中待测因子的浓度处于ELISA试剂盒的最佳检测范围。根据待测因子含量高、中、低的不同，分别采取不同的稀释方案，以下方案仅供参考，样品的稀释应有详细记录。
- 高：指待测因子在20～200ng/ml。一般按1:100稀释。297μL样品稀释液加3μL样品。
- 中：指待测因子在2～20ng/ml。一般按1:10稀释。225μL样品稀释液加25μL样品。
- 低：指待测因子在31.2～2000pg/ml。按1:2稀释。100μL样品稀释液加100μL样品。
- 特低：指待测因子≤31.2pg/ml。样品一般不做稀释，按每孔100μL样品直接加入。
- Legumain标准品的稀释和使用：在使用前2小时内准备。试剂盒提供2管标准品，每管10ng，每次使用1管。
- 配制10,000pg/ml标准品：取1mL样品稀释液加入标准品管内，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解。
- 配制2000pg/ml标准品：取0.2mL 10,000pg/ml的标准品加入有0.8mL样品稀释液的Eppendorf管中，混匀，做上标记。
- 配制1000pg/ml～31.2pg/ml标准品：准备6只Eppendorf管，每管加0.3mL样品稀释液，分别标记上1000pg/ml,500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.2pg/ml。取0.3mL 2000pg/ml的标准品加入标记1000pg/ml的管中，混匀后同样取出0.3mL，加入下一只管中。余同此类推，直到最后一只样品管。
注意：已经稀释的标准品（10,000pg/ml），应在12小时内使用。-20℃冷冻保存条件下，2天内可以使用，但不得反复冻融。
- 配制10,000pg/ml标准品：取1mL样品稀释液加入标准品管内，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解。
- 生物素标记抗人Legumain抗体工作液的准备：在使用前2小时内准备。
- 根据每孔需要100μL计算总的用量（实际配制时应多配制100～200μL）。
- 按1μL生物素标记抗人Legumain加抗体稀释液99μL的比例配制工作液。轻轻混匀。
- 根据每孔需要100μL计算总的用量（实际配制时应多配制100～200μL）。
- 亲和素-过氧化物酶复合物（ABC）工作液的准备：在使用前1小时内准备。
- 根据每孔需要100μL计算总的用量（实配时应多配制100～200μL）。
- 按1μL亲和素-过氧化物酶复合物（ABC）加ABC稀释液99μL的比例配制工作液。轻轻混匀。
- 根据每孔需要100μL计算总的用量（实配时应多配制100～200μL）。
已稀释好的ABC和TMB显色液在加入酶标板孔前都应预先在37℃中平衡至少30分钟。试剂或样品稀释时，切不可忘记混匀。每次检测都应该做标准曲线。用户须估计样品待测因子的含量，决定适当的稀释倍数。
- 确定本次检测所需的已包被抗体的酶标板孔数目，并增加1孔作为TMB空白显色孔。总数=样品数+9；做双份检测时×2。其余重包装好放入冰箱中。
- 将2000pg/ml,1000pg/ml，500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.2pg/ml的标准品各100μL依次加入一排7孔中，1孔只加样品稀释液的作为零孔。对于人血清、血浆、细胞裂解液或细胞培养上清，直接加已用样品稀释液稀释的样品100μL。
- 酶标板加上封板膜，37℃反应90分钟。
- 反应后用自动洗板机吸去酶标板内的液体；或甩去酶标板内液体，再对着吸水纸拍几下。不洗。
- 将准备好的生物素抗人Legumain抗体工作液按每孔100μL依次加入（TMB空白显色孔除外）。
- 酶标板加上封板膜，37℃反应60分钟。
- 1X洗涤缓冲液洗涤3次，每次浸泡1分钟左右（每孔洗液至少300μL）。
- 将准备好的ABC工作液按每孔100μL依次加入（TMB空白显色孔除外）。
- 酶标板加上封板膜，37℃反应30分钟。
- 1X洗涤缓冲液洗涤5次，每次浸泡1～2分钟左右（每孔洗液至少300μL）。
- 按每孔90μL依次加入已在37℃平衡30分钟的TMB显色液，37℃避光反应15～20分钟。
注意：显色时间供参考，因用户实验室条件差异，最佳显色时间会有所不同。此时肉眼可见标准品的前3～4孔有明显的梯度蓝色，后3～4孔差别不明显。 - 按每孔100μL依次加入终止液，此时蓝色立转黄色。
- 用酶标仪在450nm测定O.D.值。
有两种设定空白对照的方案：
① 将TMB空白显色孔(只加TMB显色液和终止液)设为对照。所有的标准品和样品的吸光值减去TMB空白显色孔的吸光值后，在坐标纸上画出曲线，以吸光值作为纵坐标，以浓度作为横坐标。
② 将零孔设为对照。所有的标准品和样品的吸光值减去零孔的吸光值后，得到的数据可以直接在坐标纸上画出曲线。 - 根据样品的吸光值在坐标上找出对应的浓度。用户也可以使用各种应用软件来计算。应记住由于样品稀释了N倍，其实际浓度应该×N。
- 加样品和标准品，37℃反应90分钟。不洗。
- 加生物素标记抗体，37℃反应60分钟。1X洗涤缓冲液洗涤3次。
- 加ABC，37℃反应30分钟。1X洗涤缓冲液洗涤5次。
- TMB 37℃反应15～20分钟。
- 加入终止液，读数。
取自某些批次质检数据，仅供参考，用户需要自己建立标准曲线。
| 浓度(pg/ml) | 0 | 31.2 | 62.5 | 125 | 250 | 500 | 1000 | 2000 |
| OD值 | 0.007 | 0.151 | 0.203 | 0.307 | 0.508 | 0.871 | 1.413 | 1.988 |
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